近日，國(guó)家食藥總局發(fā)布《食用油脂中辣椒素的測(cè)定》食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法。本方法規(guī)定了食用油脂中辣椒素（天然辣椒素、合成辣椒素、二氫辣椒素）含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。適用于食用油脂中辣椒素（天然辣椒素、合成辣椒素、二氫辣椒素）含量的測(cè)定。

【原理】

試樣經(jīng)二氯甲烷溶解，氫氧化鈉水溶液提取酸化后，過(guò)固相萃取柱凈化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

【試劑材料】

水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

乙腈（CH3CN）：色譜純。

甲醇（CH3OH）：色譜純。

甲酸（CH2O2）：質(zhì)譜級(jí)。

二氯甲烷（CH2Cl2）：色譜純。

氫氧化鈉（NaOH）：分析純。

濃硫酸（H2SO4）：98%，分析純。

【標(biāo)準(zhǔn)溶液】

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱(chēng)取天然辣椒素、合成辣椒素、二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g（精確至0.000 1 g），用甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為1 mg/mL。貯存于4 ℃冰箱中，有效期3個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量于容量瓶中，用甲醇將其稀釋成含量分別為0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列混合工作液。臨用時(shí)配制。

【儀器和設(shè)備】

LC-10Tvp高效液相色譜-島津LCMS-2010液質(zhì)聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源。

C18 固相萃?。⊿PE）小柱：1000 mg，6 mL，或等效SPE柱。

超聲波清洗器。

分析天平：感量為0.000 1 g。

離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4000 r/min。

渦旋混合器。

【試樣制備】

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g（精確至0.000 1 g）樣品于10 mL具塞塑料試管中，加入1 mL二氯甲烷，再加入3 mL 2%氫氧化鈉溶液，渦旋提取10 min，4000 r/min離心10 min，取上層水相；殘留有機(jī)相再用3 mL 2%氫氧化鈉溶液重復(fù)提取一次，合并水相，再用稀硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至2-3之間后進(jìn)行固相萃取操作。C18 SPE小柱預(yù)先用3 mL乙腈淋洗3次，再用3 mL純水淋洗2次進(jìn)行活化，然后將調(diào)節(jié)完pH值的水相提取液加入小柱，控制流速至每秒1-2滴，待全部溶液通過(guò)SPE小柱后，以3 mL超純水淋洗2次，棄去流出液，最終以3 mL乙腈洗脫2次。乙腈洗脫液50℃氮吹近干，用0.5 mL甲醇溶解后過(guò)微孔濾膜（0.22 μm，有機(jī)相），過(guò)濾液置于進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)襯管中供LC-MS/MS測(cè)定。

【色譜條件】

色譜柱：C18柱，1.8 μm，100 mm×2.1 mm（內(nèi)徑），或性能相當(dāng)者；

流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液（3.2.1），B為0.1%甲酸乙腈溶液（3.2.2）

流速：0.3 mL/min；

柱溫：40 ℃；

進(jìn)樣量：2 μL。

洗脫梯度：

【質(zhì)譜條件】

電離方式：電噴霧正離子模式；

b）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；

c）霧化氣壓力：30 psi；

d）離子噴霧電壓：4000 V；

e）干燥氣溫度：500 ℃；

f）干燥氣流速：8 L/min；

g）定性離子、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量。

【定性測(cè)定】

按照上述條件測(cè)定試樣和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，如果試樣中的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中的某種組分一致（變化范圍在±2.5%之內(nèi)）；且試樣中定性離子的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的定性離子相對(duì)豐度相比，相對(duì)豐度（k）偏差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍，則可判定為試樣中存在該組分。

【定量測(cè)定】

將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別按儀器參考條件進(jìn)行測(cè)定，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積。以混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

圖B.1 合成辣椒素MRM色譜圖  圖B.2 天然辣椒素MRM色譜圖  圖B.3 二氫辣椒素MRM色譜圖

【試樣溶液測(cè)定】

將試樣溶液按儀器參考條件進(jìn)行測(cè)定，得到相應(yīng)的樣品溶液的色譜峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到待測(cè)液中組分的濃度，平行測(cè)定次數(shù)不少于兩次；樣品中各待測(cè)組分的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性響應(yīng)范圍內(nèi)，若超出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍，應(yīng)用甲醇稀釋后進(jìn)行分析。

【結(jié)果】

此方法的檢出限為：合成辣椒素0.05 μg/kg；天然辣椒素0.03 μg/kg；二氫辣椒素0.02 μg/kg。

此方法的定量限為：合成辣椒素0.2 μg/kg；天然辣椒素0.1 μg/kg；二氫辣椒素0.1 μg/kg。

本方法所測(cè)定的樣品中辣椒素（合成辣椒素、天然辣椒素和二氫辣椒素）總含量大于或等于1.0 μg/kg時(shí)，該油脂樣品可能存在異常, 提示存在使用餐廚回收油脂的可能。